Agustini Rahayu memulai karier sebagai PLT. Kepala seksi Pengembangan Destinasi Pariwisatapada tahun 2004, kemudian diangkat menjadi Kepala Seksi Eropa Barat pada tahun 2006-2012. Melanjutkan karier sebagai Kepala Subdirektorat Strategi Pencitraan Indonesia, Kepala Bidang Eropa, dan Kasubdit Komunikasi Pemasaran pada tahun 2012-2018. Pada tahun 2018, beliau diangkat  sebagai Asisten Deputi Pemasaran wilayah Eropa lalu Kepala Biro Komunikasi pada tahun 2020. Akhir tahun 2021 kembali mendedikasikan diri pada bidang pemasaran sebagai Direktur Promosi Pariwisata Wilayah Eropa, Amerika, Timur Tengah, Afrika dan Asia Pacific hingga tahun 2022 sebelum kemudian melanjutkan karier sebagai Direktur Kajian Strategis di Kementerian Pariwisata dan Ekonomi Kreatif/Badan Pariwisata dan Ekonomi Kreatif.

Pada 6 Januari 2025 beliau diberikan mandat sebagai Deputi Bidang Kreatifitas Media  yang membawahi sub sektor Film, Animasi, Video, Musik, TV & Radio, Periklanan, Penerbitan dan Fotografi. Menjalin jejaring dengan berbagai komunitas dan industri, beliau memimpin tim mencapai berbagai terobosan program pembukaan akses distribusi dan komersialisasi bagi para pelaku Ekonomi Kreatif, dimulai dengan kerjasama promosi berbagai film nasional  hingga ke tingkat global, mendorong industri musik lokal meningkat menjadi kelas nasional hingga internasional, memperjuangkan fasilitasi lainnya untuk meningkatkan ekosistem dan rantai nilai ekonomi kreatif dibidang media termasuk diantaranya memperjuangkan rekonstruksi kebijakan perpajakan bagi para penulis agar lebih sederhana, adil, dan berpihak dan terus mengawal kemudahan lainnya melalui berbagai terobosan di 9 industri dan 6 sub sektor Ekonomi Kreatif yang menjadi tanggung jawab kerjanya. 

Menyikapi dinamika kebutuhan organisasi, pada 6 April 2026, beliau diberikan tugas baru sebagai Staf Ahli Menteri Bidang Kekayaan Intelektual dan Transformasi Digital.